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中华人民共和国农业行业标准--固氮菌肥料

(发布日期:2005-4-12 11:03:58)
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中华人民共和国农业行业标准 

固 氮 菌 肥 料 

Azotobacter fertilizer 

2000-12-22发布 2001-04-01实施 

中华人民共和国农业部 发 布 

前 言 

本标准在原有标准 NY227-1994《微生物肥料》的基础上,对其中的固氮菌肥料部分进行修改。 

主要修改内容如下: 

—在技术要求中删除成品无害化指标; 

—在检验方法中增加允许差,并增加抽样和判定规则。 

本标准自实施之日起,同时代替 NY227-1994中的固氮菌肥料部分。 

本标准的附录 A、附录B、附录C都是标准的附录。 

本标准由中华人民共和国农业部提出。 

本标准起草单位:农业部微生物肥料质量监督检验测试中心、中国农业科学院土壤肥料研究所。 

本标准主要起草人:李元芳、吴观以、李慧荃、葛诚、沈德龙。 

固氮菌肥料 

Azotobacter fertilizer 

1 范围 

本标准规定了固氮菌肥料的分类、技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存等。 

本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气 ,供作物氮素营养,又能分泌激素剌激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌(PGPR)的复合固氮菌肥料。 

2 引用标准 

下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时,所示版本均有效。所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 

GB/T 625一1989 化学试剂 硫酸 

GB/T 629一1997 化学试剂 氢氧化钠 

GB/T 1250一1989 极限数值的表示方法和判定方法 

GB/T 6543一1986 瓦愣纸箱 

GB/T 6682一1992 分析实验室用水规格和试验方法 

3 定义 

本标准采用下列定义: 

3.1 自生固氮菌 

在土壤里能固定空气中的氮,供作物氮素营养,又能分泌激素刺激作物生长的微生物。 

3.2根际联合固氮菌 

既依赖根际环境生长,又在根际中固定空气中的氮气,对作物的生长发育产生积极作用的微生物。 

3.3 固氮效能 

固氮菌每消耗 1g碳水化合物(糖)从空气中摄取氮素的毫克数,固氮 效能用mg氮/g糖表示。 

4 产品分类 

4.1 按形态不同,分为液体固氮菌肥料、固体固氮菌肥料和冻干固氮菌肥料。 

4.2 按菌种及特性分为:自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。 

5 技术要求 

5.1 菌种 

在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮,并具有一定固氮效能。菌体一般为短杆状(固氮螺菌属菌体呈螺旋状),革兰氏染色阴性。 

5.1.1 自生固氮菌 

用固氮菌属( Azotobacter)、氮单胞菌属(Azomonas)的菌种,也可用茎瘤根瘤菌(Azorhizobium)和固氮芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)的菌株。 

5.1.2 根际联合固氮菌 

可用下列菌种:固氮螺菌( Azospirillum);阴沟肠杆菌(Enteroba)经鉴定为非致病菌的菌株;粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)经鉴定为非致病菌的菌株;肺炎克氏杆菌(Klebseilla pneumoniae)经鉴定为非致病菌的菌株。 

使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时,菌种必须经过鉴定,并符合 5.1要求。 

生产固氮微生物肥料所使用的菌种,必要时还要进行菌种染色鉴别(见附录 B)和菌种固氮效能测定(见附录C)。 

5.2 成品技术指标(见表1) 

表 1 成品技术指标 

项目 
 液体 
 固体 
 冻干 
 
外观、气味 
 乳白或淡褐色液体,浑浊,稍有沉淀,无异臭味 
 黑褐色或褐色粉状,湿润、松散,无异臭味 
 乳白色结晶,无味 
 
水分, % 
 - 
 25.0 ~ 35.0 
 3.0 
 
pH值 
 5.5 ~ 7.0 
 6.0 ~ 7.5 
 6.0 ~ 7.5 
 
细度,过孔径 0.18mm标准筛的筛余物,% ≤ 
 2 
 20.0 
 - 
 
有效活菌数,个 /ml 

(个/g、个/瓶 ) ≥ 
 5.0×10 8 
 1.0×10 8 
 5.0×10 8 
 
杂菌率 1) , % ≤ 
 5.0 
 15.0 
 2.0 
 
有效期 2) , 月 ≥ 
 3 
 6 
 12 
 
1) 其中包括10 -6 马丁培养基平板上无霉菌。 

2) 此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测。 
 

6 抽样 

按每一发酵罐菌液制成的产品为一批,逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。 6.1 抽样工具及用品 

抽样前预先准备好无菌塑料袋 (或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机(或封口胶带)、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。 

6.2 抽样数量及抽样方法 

在成品库抽样,按“ ”形分层设点抽样,抽样以件为单位,小包装产品以一包装箱为一件。大包装(30-50kg)产品以一袋(或一桶)为一件。抽样基数由样品基数的大小确定。1-10件,全部抽样。11-200件,抽样10件;201-400件,抽取20件。样品基数大于400件,按照超过部分的2%增加抽样件数。总件数不超过40件。 

每件小包装产品抽取一小袋,在无菌条件下每袋取样 200g。将所有样品混匀,按四分法缩到2000g,分装4袋,然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。 

液体产品每件吸取 10mL,一同防入无菌的三角瓶中,混匀后分成两份,每份250mL。冻干产品,每件取一支防入无菌的三角瓶中,加无菌液体培养液,溶解混匀后分成两份,每份50mL。贴上抽样标签和封条(一份被抽样单位留存,一份交检测中心检测)。 

7 检验方法 

7.1 仪器设备及试剂 

7.1.1 仪器设备 

生物显微镜( 10×100); 

菌落计数器; 

恒温培养箱; 

恒温干燥箱; 

恒温摇床; 

灭菌锅; 

无菌室或超净工作台; 

酸度计; 

试管:ф 15mm×150mm,ф18mm×180mm; 

培养皿:直径 9cm; 

三角瓶: 500mL; 

无菌吸管: 1、2、5、10mL; 

玻璃刮刀; 

滤纸; 

酒精灯; 

标准筛:孔径 0.18mm和0.15mm; 

1号羊毛画笔; 

无菌水; 

无离子水。 

7.1.2 试剂 

选择培养基(附录 A); 

刚果红染液( 0.5%)。 

7.2 成品检验 

7.2.1 气味检验 

取固氮菌肥料样品打开包装,进行感官检验。 

7.2.2 外观检验 

将固体固氮菌肥料包装打开,装在白色搪瓷盘中,将液体固氮菌肥料摇匀,在明亮光线下进行感官检验。 

7.2.3 pH值测定 

液体固氮菌肥料的 pH值测定:取供检菌液直接测定pH值,取三次测定结果的平均数。 

固体固氮菌肥料的 pH值测定:取50mL烧杯一个,加入菌肥25g,无离子水25mL。通过磁力搅拌使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。 

7.2.4 含水量测定 

称取固体固氮菌肥料三份,每份 20.00g,精确到0.01g,放入已称恒重的铝盒中。置105℃干燥箱内烘烤4h,移至干燥器内,冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(l)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。 

含水量 (%)=(m 0 -m 1 )/m 0 ×100                       ………………(1) 

式中: m 0 一烘干前样品质量,g 

      m 1 一烘干后样品质量,g。 

7.2.5 吸附剂颗粒细度测定 

称样 10.00g(精确至0.01g),置于标准筛中(直径分别为0.18mm和0.15mm),用水冲洗,用毛笔轻刷,至粉末不再通过为止。将筛余物置105~110℃温度下烘干,称重。筛余物百分含量按式(2)计算: 

筛余物 (%)=筛余物质量/(1-样品含水量百分数)/样品质量×100 ………(2) 

7.2.6 有效活菌数及杂菌率的测定 

采用平板计数法测定固氮菌活菌数及杂菌率。 

采样应不少于 500g,从中抽取10.00g,加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取l0mL加入90mL的无菌水中),静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min,即成母液的菌悬液。 

用无菌吸管分别吸取 5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中,混匀成1:10稀释的菌悬液,这样依次稀释,分别得到1:1×10 2 ,1:1×10 3 ,1:1×10 4 ,1:1×10 5 等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。 

用 0.5mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL,加至直径为9cm的选择培养基(见附录A)表面,用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面,或取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内,与琼脂培养基混匀,每个样品取3个连续适宜稀释度,每一稀释度重复3次,同时加无菌水的空白对照。28℃培养2~3d后每个稀释度取5~10个菌落的菌体,涂片染色(见附录B)。显微镜观察识别后,选一个适宜稀释度(菌落在30~300个之间的平板),计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。 

杂菌数是指在选择培养基上,除有效活菌外的其他种菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基 10-4稀释度菌悬液加样,操作步骤同样品有效活菌数检测操作。 

7.2.6.2 允许差 

平行样品误差按式( 3)计算,并应符合表2的规定。 

……………… (3) 

                表2 平板上菌落数对应的单一标准差 

7.2.6.3 测定结果的计算 

按式( 4)、式(5)计算样品的有效活菌数及杂菌率 

有效活菌数(个 /g)=菌落平均数×稀释倍数×母液菌悬液的体积/菌剂克数或毫升数/加样量 …………(4) 

杂菌率 (%)=杂菌总数/(固氮菌数+杂菌总数)×100              …………………(5) 

7.2.7有效期检验 

在产品说明书标明的有效期到达前 10d测定成品各项指标,方法同7.2.1 ~ 7.2.6。 

8 检验规则 

8.1 检验分类 

8.1.1 产品出厂检验 

产品交货时进行的检验。 

8.1.2 产品型式检验 

新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。 

8.2 检验项目 

型式检验的检验项目按 5.2要求进行。出厂检验不检有效期。 

8.3 判定规则 

8.3.1 合格产品: 

a)       检验结果符合 5.2所规定的技术指标的产品为合格产品; 

b)       产品有效活菌数符合指标,杂菌率不符合指标,但小于本标准规定的两倍时(液体 10%、固体30%、冻干瓶4%),而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30×10 -5 ,其他指标有一项不符合,也可判为合格产品; 

c)       产品有效活菌数及杂菌率符合指标,在水分、外观、 pH值、细度等次要检测项目中,有3项不符合技术指标,也判为合格产品。 

8.3.2 不合格产品: 

a)        产品有效活菌数不符合技术指标或投入菌种没有完全相应的检验出,判为不合格产品; 

b)        产品杂菌率超过本标准规定的两倍(液体 10%、固体30%、冻干瓶4%),判为不合格品; 

c)        产品有效活菌数符合指标,杂菌率不符合指标,但小于本标准规定的两倍时(液体 10%、固体30%、冻干瓶4%),其他指标有两项不符合,判为不合格产品; 

d)        产品检验在马丁培养基平板上霉菌数≥ 30×10 -5 ,判为不合格产品; 

e)        产品水分、 pH值、细度、外观等次要检测项目中,有4项不符合技术指标,判为不合格产品。 

8.3.3 含有植物促生根际细菌(PGPR)的固氮菌肥料产品检测时,只测固氮菌数量,不测植物促生根际细菌的数量,也不视其为杂菌。 

8.3.4 本标准中质量指标合格判断,采用GB/T 1250中修约值比较。 

9 包装、标识、运输和贮存 

9.1 包装 

9.1.1 内包装 

液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶,大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管真空干燥。 

9.1.2 外包装 

外包装采用纸箱,纸箱质量应符合 GB/T 6543要求。箱外用尼龙打包带加固。 

9.1.3 每箱(袋)产品中附有产品合格证和使用说明书,在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。 

9.2 标识 

在包装箱 (袋)上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产日期、批号和净重,并印有防晒、防潮、防冻等标记,若有必要还要加印易碎、防倒置等标记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。 

9.3 运输 

适用于常用运输工具,运输过程中有遮盖物,防止雨淋、日晒及 35℃以上高温。气温低于0℃时采取保温措施,防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸,避免包装破损。 

9.4 贮存 

产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内,最适温度为 10℃ ~ 25℃,不得露天堆放,以防雨淋和日晒,避免冻冰及长时间35℃以上高温。 

附 录 A 

(标准的附录) 

有效活菌数和杂菌(霉菌)测定的选择培养基 

A1、固氮菌用阿须贝(Ashby)培养基 

磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 ) 0.2g 

硫酸镁( MgSO 4 ?7H 2 O) 0.2g 

氯化纳 (NaCl) 0.2g 

碳酸钙 (CaC0 3 ) 5.0g 

甘露醇( C 6 H 14 O 6 ) 10.0g 

硫酸钙 (CaS0 4 ?7H 2 O) 0.lg 

pH值 7.0 

A2、固氮(茎瘤)根瘤菌培养基 

乳酸钠( C 3 H 5 O 3 Na) 10.0g 

磷酸氢二钾( K 2 HPO 4 ) 1.67g 

磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 ) 0.87g 

氯化纳 (NaCl) 0.05g 

氯化钙 (CaCl 2 ) 0.04g 

氯化铁 (FeCl 3 ) 0.004g 

硫酸镁 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.1g 

酵母膏 1.0g 

(或酵母粉 0.8g) 

pH 6.8 

A3、联合固氮菌培养基 

D-葡萄糖酸钠(C 6 H 11 O 7 Na) 5.0g 

磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 ) 0.4g 

磷酸氢二钾( K 2 HPO 4 ) 0.1g 

硫酸镁 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.2g 

氯化纳 (NaCl) 0.1g 

氯化钙 (CaCl 2 ) 0.02g 

氯化铁 (FeCl 3 ) 0.01g 

硫酸镁 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.1g 

酵母膏 1.0g 

(或酵母粉 0.8g) 

钼酸钠 (Na 2 Mo0 4 ) 0.002g 

pH 6.8~7.0 

A4、马丁培养基(测霉菌数) 

磷酸氢二钾( K 2 HPO 4 ) 1.0g 

硫酸镁 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.5g 

葡萄糖( C 6 H 12 O 6 ?H 2 0) 10.0g 

蛋白胨 5.0g 

1%孟加拉红水溶液 3.3mL 

[四氯四碘荧光素(C 20 H 4 Cl 4 I 4 O 5 )] 

每升培养基中加入 0.1g氯霉素,一起灭菌。 

注:以上各培养基需蒸馏水 1000mL,琼脂18 ~ 20g。 

附 录 B 

(标准的附录) 

染色剂和染色方法 

B1 荚膜染色法 

B1.1 染色剂 

石碳酸复红染色液 

甲液:碱性复红 (Basicfuchsin)(C 20 H 20 ClN 3 ) 0.3g 

95%酒精 10.0mL 

乙液:石碳酸( C 6 H 5 OH) 5.0g 

蒸馏水 95.0mL 

a)将碱性复红在研钵中研磨后,逐渐加入95%酒精,继续研磨使之溶解,配成甲液。 

b)将石碳酸溶解在蒸馏水中配成乙液。 

c)将甲液和乙液混合摇匀,成为石碳酸复红,通常可将混合液稀释5~10倍使用。稀释液容易变质失效,一次不宜多配。 

B1.2 染色方法 

B1.2.1 取少量培养菌液涂于载玻片水滴中,涂成薄层。 

B1.2.2 自然干燥或稍加热。 

B1.2.3 在石碳酸复红染1min后,水洗,干后镜检。 

B1.3 染色结果 

菌体为红色,菌体周围有一层透明圈即为荚膜。 

B2 芽胞染色法 

B2.1 染色剂 

B2.1.1 5%孔雀绿 

孔雀绿( C 23 H 25 ClN 2 ) 5.0g 

蒸馏水 100mL 

B2.1.2 0.05%碱性复红 

碱性复红 (Basicfuchsin)(C 20 H 20 ClN 3 ) 0.5g 

95%酒精 100mL 

B2.2 染色方法 

B2.2.1 制片 

B2.2.2 加孔雀绿染液3~5滴于涂片处,酒精灯火焰加热至冒汽,但不沸腾,并随时补加染液,维持涂片处不干,染色约5~10min。 

B2.2.3 自来水冲洗30s。 

B2.2.4 用0.05%碱性复红染色1min,水洗,镜检(若0.05%碱性复红浓度太高,可根据具体情况适当稀释)。 

B2.3 染色结果 

芽胞绿色,菌体红色。 

B3 革兰氏染色法 

B3.1 染色剂 

B3.1.1 结晶紫染色液 

甲液:结晶紫 2g 

乙醇 (95%) 20mL 

乙液:草酸镀 0.8g 

蒸馏水 80mL 

甲、乙液相混合,静置 48h后使用。 

B3.1.2 卢哥(Lugol)氏碘液 

碘 (I 2 )片 1.0g 

碘化钾 (KI) 2.0g 

蒸馏水 300mL 

先用少量 (3~5mL)蒸馏水溶解碘化钾,再投入碘片,待碘全溶后,加水100mL,配成母液,使用时加两倍水,稀释成卢哥氏碘液。 

B3.1.3 脱色液(95%的乙醇) 

B3.1.4 复染液(0.5%的番红水溶液) 

取 2.5g番红,溶于l00mL无水酒精中。取番红酒精溶液20mL,加入80mL蒸馏水,即成0.5%的番红水溶液。 

B3.2 染色方法 

B3.2.1 制片 

B3.2.2滴加结晶紫液,覆盖1min。 

B3.2.3 用水冲净结晶紫液。 

B3.2.4 滴加碘液冲去残水,并覆盖约1min。 

B3.2.5 用水冲去碘液,用吸水纸吸去水分。 

B3.2.6 加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,30s后水洗,吸去水分。 

B3.2.7 番红染色液染10s后,自来水冲洗。干燥,镜检。 

B3.3 染色结果 

革兰氏正反应菌体呈紫色,负反应菌体呈红色。 

B4 鞭毛染色 

B4.1 染色剂 

甲液:单宁酸( C 76 H 52 O 46 ) 5.0g 

氯化铁( FeCl 3 ) 1.5g 

15%甲醛(HCHO) 2.0mL 

1%氢氧化钠(NaOH) 1.0mL 

蒸馏水 100mL 

乙液:硝酸银( AgNO 3 ) 2g 

蒸馏水 100mL 

待硝酸银溶解后,取出 10mL备用,其余的90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵,则形成很厚的沉淀,再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴入,则出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状的沉淀又消失,再滴入硝酸银,直到摇动后,仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止(如雾重,则银盐沉淀出,不宜使用)。 

B4.2 染色方法 

B4.2.1 涂片:在载玻片的一端滴一滴蒸馏水,用接种环挑取斜面上少许菌苔,在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜,使菌液随水滴缓慢流到另一端,然后平放在空气中干燥。 

B4.2.2 涂片干燥后,滴加甲液3~5min,用蒸馏水冲洗。加乙液染30~60s,并在酒精灯上加热,使其稍冒汽而染液不干,然后用蒸馏水冲洗,干后镜检。 

B4.3 染色结果 

菌体为深褐色,鞭毛为褐色。

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